第150期? 尺寸排阻色譜法填料的選擇
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一、什么是尺寸排阻色譜
利用填料的細孔，根據分析樣品中各分子大小的差異進(jìn)行洗脫的分離模式。取Size Exclusion Chromatography 開(kāi)頭字母，簡(jiǎn)寫(xiě)為SEC。由于填料與分析樣品之間不發(fā)生相互作用（如吸附）， 因此，這是一種分析樣品變性發(fā)生可能性較低的分離模式。此外，該模式只使用單一流動(dòng)相，相對簡(jiǎn)單的設備就能進(jìn)行穩定的分析，且當知道有關(guān)分子量（大?。┑男畔r(shí)，還可以預測洗脫位置。另外，還有可以在保持聚體不解離的情況下即可對其進(jìn)行分離的一大特長(cháng)。 分離模式圖如圖1-1 所示。色譜柱中充填了具有幾十到幾百納米細孔的填料。分子通過(guò)色譜柱時(shí)，尺寸較小的分子滲透至填料的細孔內部，像繞行一樣繞過(guò)色譜柱內部流過(guò)。另一方面，尺寸較大的分子由于無(wú)法滲透至細孔內部，從填料外側流過(guò)。結果，分子尺寸較大的分子較早洗脫，較小的分子較晚洗脫。
圖1-1 尺寸排阻色譜法的分離示意圖
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? ? 圖1-2 是色譜柱內示意圖和分子量計算用校正曲線(xiàn)示例。校正曲線(xiàn)是通過(guò)測定已知分子量的分子量標準物質(zhì)，以各自的分子量對數與洗脫體積（或洗脫時(shí)間）繪制而來(lái)。比填料細孔直徑大的分子無(wú)法滲透到填料內部，因此，它們由填料外部體積部分流出，并從色譜柱中洗脫出來(lái)（這稱(chēng)為空隙體積或排阻極限洗脫體積VO）。無(wú)論什么分子，在理論上，其洗脫速度不會(huì )比VO 快。另一方面，比細孔小的分子則根據尺寸滲透到細孔內部。流動(dòng)相總體積VM是流經(jīng)填料外部的體積（VO）和填料內的細孔內體積（Vi）之和（= 流動(dòng)相體積，VM= VO + Vi）。因此，在理論上，沒(méi)有洗脫遲于VM 的分子。該體積稱(chēng)為總滲透極限洗脫體積。所有分子均在排阻極限洗脫體積（VO）和總滲透極限洗脫體積（VM）之間洗脫，從分子尺寸較大的開(kāi)始，依次進(jìn)行洗脫。
圖1-2 尺寸排阻色譜用色譜柱的示意圖和校正曲線(xiàn)
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二、填料選擇
1. 基質(zhì)種類(lèi)
尺寸排阻色譜主要有兩種填料，一種是以硅膠作為基質(zhì)的硅膠類(lèi)填料，另一種是以多孔聚合物為基質(zhì)的聚合物類(lèi)填料。由于蛋白的單個(gè)分子量通常在1萬(wàn)到數十萬(wàn)Da之間，分離時(shí)，一般使用在特定分子量區間中校正曲線(xiàn)斜率較緩的硅膠類(lèi)填料的色譜柱。硅膠類(lèi)填料機械強度高，耐壓性好，而且，還有小粒徑填料裝填的高分辨率色譜柱可選用。圖1-3是標準蛋白硅膠類(lèi)填料的校正曲線(xiàn)，圖1-5是標準樣品的分離色譜圖。
? ? 另一方面，與硅膠類(lèi)填料相比，聚合物類(lèi)填料色譜柱的校正曲線(xiàn)的坡度較陡，但分子量分離范圍較寬，校正曲線(xiàn)的線(xiàn)性也很好，因此，適用于核酸等具有分子量分布的分析樣品的分離。另外，還有大孔徑的色譜柱，可適用于病毒和DNA等巨型生物大分子的分離。同時(shí)還具有耐堿性，可在較大的pH值范圍內使用，可以使用堿溶液進(jìn)行清洗。圖1-4是標準蛋白聚合物類(lèi)填料的校正曲線(xiàn)，圖1-6是標準樣品的分離色譜圖。
圖1-3 校正曲線(xiàn)（硅膠基質(zhì)填料）??? ?????????圖1-4 校正曲線(xiàn)（聚合物基質(zhì)填料）
圖1-5標準樣品的分離實(shí)例（硅膠基質(zhì)填料）圖1-6 標準樣品的分離實(shí)例（聚合物基質(zhì)填料）
2. 基質(zhì)的種類(lèi)和特點(diǎn)
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基質(zhì) | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
硅膠類(lèi)填料 | 孔分布狹窄，特定分離范圍內分辨率較高，剛性好，可進(jìn)行高速分離 | 不耐堿 |
聚合物類(lèi)填料 | 孔分布較寬，校正曲線(xiàn)在較大范圍內具有良好的線(xiàn)性 耐堿 有較大粒徑的色譜柱，可輕松放大至分離制備 | 分辨率低于硅膠類(lèi)填料 |
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3. 孔 徑
孔徑?jīng)Q定可以分離的分子尺寸，因此，選擇適合所測分子孔徑的色譜柱是必要的。具體而言，應選擇所測分子在校正曲線(xiàn)較為平緩的范圍內洗脫的色譜柱。測定分子量分布較寬的分子時(shí)，可將填料孔徑不同的色譜柱串聯(lián)。
4. 粒 徑
粒徑越小，理論塔板數越高，分辨率就高。另一方面，壓力損失與粒徑的平方呈反比，粒徑越小時(shí)，色譜柱壓力越高。因此，選擇時(shí)需要同時(shí)考慮所使用的儀器的耐壓性能。使用不同粒徑的色譜柱分離標準樣品的色譜圖如圖1-7所示?？梢钥闯?，粒徑為5 μm 的 TSKgel G3000SWXL與粒徑為 2 μm 的 TSKgel UP-SW3000 相比，后者峰形更尖銳，理論塔板數也更高，即分辨率更高。
圖1-7 粒徑對分離的影響
