一、什么是疏水色譜？
? 蛋白等大分子電解質(zhì)在不含鹽的水溶液中，由于同種電荷會(huì )發(fā)生靜電相互排斥作用，因此溶解度不高。添加鹽會(huì )削弱靜電排斥作用并提高溶解度，即所謂salt in（鹽溶）現象。進(jìn)一步提高鹽濃度，與蛋白結合（水和）并穩定其溶解的水會(huì )被鹽奪走。其結果是，被水和覆蓋的疏水部位露出，引起彼此之間的疏水相互作用并開(kāi)始沉淀，即所謂salt out（鹽析）現象。在疏水色譜中，使用高濃度鹽的流動(dòng)相，在導入了疏水性官能團的填料和分析樣品之間產(chǎn)生疏水性相互作用，使得樣品組分結合到填料上。其后，逐漸降低鹽濃度，疏水性相互作用減弱，分析樣品從填料中被洗脫出來(lái)。分析樣品不同組分其相互作用的程度不同，因此，可在不同鹽濃度下發(fā)生洗脫。氨基酸組成和立體結構是決定疏水性的重要原因，同時(shí)疏水相互作用和分子尺寸之間也有較弱的關(guān)聯(lián)。一般而言，分子量越大，疏水相互作用表現出越強（＝洗脫遲緩）的趨勢。
二、色譜柱（填料）的選擇
?官能團的種類(lèi)和疏水性的強弱如下圖所示。雖然疏水性的強弱基本取決于官能團，但還是會(huì )受到鍵合密度的影響，密度越高，疏水性越高。另外，芳香族官能團和脂肪族官能團，受π電子引起的相互作用的影響，選擇性上存在略微差異。
? 考慮分析樣品向孔內部的滲透、擴散引起的傳質(zhì)效應，一般選擇較大孔徑的（例如，約100 nm）填料。但在純化過(guò)程中，考慮到效率，有時(shí)也會(huì )選擇對實(shí)際分析樣品吸附載量最大所對應孔徑的填料。TOYOPEARL Phenyl-600、PPG-600、Butyl-600等600系列的孔徑設計為75 nm左右，大多用于分子尺寸與抗體相同或類(lèi)似的分析樣品的純化。TOYOPEARL Butyl-550的孔徑設計得較小，約為50 nm，適用于小分子蛋白和肽的純化。疏水色譜中使用的基質(zhì)如下表所示。非多孔性填料是在無(wú)孔聚合物基質(zhì)填料表面導入了疏水官能團的高速、高分辨率用填料。無(wú)需考慮向孔內的擴散，因此適用于所有分子尺寸的分析樣品。然而非多孔性填料的有效表面積較小，導致樣品載量較少，同時(shí)還需要注意雜質(zhì)可能造成的污染。
?使用梯度洗脫時(shí)，色譜柱長(cháng)度對分辨率的影響較小，不需要為了提高分辨率而增大色譜柱長(cháng)度。另一方面，在吸附載量較重要的純化工藝中，色譜柱長(cháng)度則對動(dòng)態(tài)吸附載量有影響。特別在高流速條件下使用長(cháng)度較短的色譜柱時(shí)，由于動(dòng)態(tài)吸附載量較低，需要考慮處理能力時(shí)，最好采用相同的色譜柱長(cháng)度（或柱床高度）或至少10 cm以上長(cháng)度的色譜柱進(jìn)行規模放大研究。
疏水色譜用填料基質(zhì)的種類(lèi)和特點(diǎn)
基 ??質(zhì) | 優(yōu) ??點(diǎn) | 缺 ??點(diǎn) |
聚合物類(lèi)填料 （多孔性填料） | 吸附載量高 有耐堿性 易于放大 | |
聚合物類(lèi)填料 （非多孔性填料） | 高速、高分辨率 有耐堿性 適用于所有分子尺寸的分析樣品 | 載量低 對雜質(zhì)造成的污染敏感 |
三、流動(dòng)相的選擇
?在疏水色譜中，緩沖液的種類(lèi)對選擇性幾乎沒(méi)有影響。大多推薦使用在中性附近具有緩沖能力的20~100 mmol/L左右的磷酸鹽緩沖液或Tris鹽酸鹽緩沖液，加入1~2 mol/L左右的硫酸銨作為流動(dòng)相使用。硫酸銨價(jià)格低廉，水溶解度高，在低溫條件下，溶解度也不會(huì )下降。由于選擇性的不同，有時(shí)也使用硫酸鈉或氯化鈉。但硫酸鈉在低溫下溶解度會(huì )大幅下降，需要注意鹽析現象。
?初始鹽濃度設定為分析樣品不會(huì )發(fā)生沉淀的鹽濃度。通常情況下，預先配制添加了多種濃度的硫酸銨（1~2 mol/L）樣品，將上清液和沉淀物分別使用SDS-PAGE等，計算分析樣品不發(fā)生沉淀的最高硫酸銨濃度，以該濃度作為初始流動(dòng)相的鹽濃度。盡量使用高鹽濃度的初始流動(dòng)相，鹽析沉淀的雜質(zhì)可以事先通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾和離心法去除。
?分析樣品的疏水性較高時(shí)，即使降低鹽濃度，也無(wú)法洗脫，或峰形展寬。此時(shí)，推薦可將少量的水溶性有機溶液（例如，異丙醇等）添加到鹽濃度較低的流動(dòng)相中。在疏水色譜中，使用鹽濃度較高的流動(dòng)相，因此，添加有機溶劑時(shí)，要注意鹽的析出。另外，添加有機溶劑，色譜柱壓力會(huì )升高，因此還需注意壓力上升，根據需要調整流速。
?
四、分離示例
1.?標準蛋白的分離示例
? 標準蛋白分離示例如下圖所示。大多情況下，流動(dòng)相使用磷酸鹽緩沖液（pH?7.0）。
2.?PEG 化蛋白的分離
?導入PEG，疏水性會(huì )增大，因此可以觀(guān)察到與PEG導入數相對應的色譜峰。下圖顯示了在木瓜蛋白酶水解后的人抗體片段（Fab）中使用PEG-N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS）衍生物制作的PEG化Fab的分析示例。
3.?抗體藥物的分離
? 抗體異構體的分離大多使用陽(yáng)離子交換色譜，但使用疏水色譜，可以得到選擇性與離子交換色譜不同的結果。5種市售抗體藥物的異構體分析示例如下圖所示。每種抗體都分離出了多個(gè)色譜峰。
4.?ADC（Antibody-drug conjugate）的分離
? ?ADC是將抗體和小分子藥物偶聯(lián)到一起的藥物?？贵w對癌細胞等表面存在的抗原進(jìn)行識別/結合，被吸收到細胞內后，在細胞內部與抗體結合的藥物顯示出藥效，可以選擇性地只殺死特定細胞。通常1個(gè)抗體偶聯(lián)3~4個(gè)小分子藥物。未偶聯(lián)藥物的抗體雖然也與抗原結合，但無(wú)小分子藥物藥效，只有作為抑制劑發(fā)揮作用的可能。相反，過(guò)多偶聯(lián)小分子藥物時(shí)，與抗原的結合能力下降，因此不建議使用。在 ADC質(zhì)量管理中，關(guān)于對藥物引入程度（即DAR：Drug to Antibody Ratio）的評價(jià)非常重要。
? 在ADC中，采用了使用抗體攜帶的氨基和還原SS結合生成的巰基導入藥物的方法。由于大多藥物的疏水性較高，因此，測定ADC中的藥物偶聯(lián)量時(shí)，一般采用疏水色譜。使用TSKgel Butyl-NPR分析ADC的示例如下圖所示。分析結果表明，二硫鍵還原后生成的巰基與藥物很好地偶聯(lián)上了。
