前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來(lái)達到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進(jìn)行過(guò)濾即可。
?
溶液交換量
控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積30％為宜；
關(guān)注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時(shí)間間隔，可根據電導色譜峰確定下一次上樣時(shí)間。
?
提高分辨率
1.保證填料裝填勻實(shí)；
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積5％為宜；
4.關(guān)注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據樣品特點(diǎn)選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強度和親水性；
?
優(yōu)化對稱(chēng)性
1.保證填料裝填勻實(shí)，拖尾→填料較松丨適當增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
?
出現肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來(lái)達到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進(jìn)行過(guò)濾即可。
?
溶液交換量
控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積30％為宜；
關(guān)注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時(shí)間間隔，可根據電導色譜峰確定下一次上樣時(shí)間。
?
提高分辨率
1.保證填料裝填勻實(shí)；
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積5％為宜；
4.關(guān)注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據樣品特點(diǎn)選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強度和親水性；
?
優(yōu)化對稱(chēng)性
1.保證填料裝填勻實(shí)，拖尾→填料較松丨適當增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
?
出現肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)不結合
1.?標簽未翻譯或標簽被包裹在結構內
需要檢查質(zhì)粒序列或將標簽移到其他位置，標簽移到其它位置仍被包裹在結構內部時(shí)，就要將標簽暴露出來(lái)
2.?優(yōu)化結合緩沖液及充分平衡層析柱
調整緩沖液（如金屬鰲合介質(zhì)和His標簽蛋白結合時(shí)pH應在7.3-8.5之間，在如肝素親和介質(zhì)和DNA聚合酶結合時(shí)鹽濃度太高影響結合，應控制在50mM以下）。
層析柱沒(méi)平衡好，柱床體系中的環(huán)境如pH，離子強度也會(huì )影響結合，層析上樣前要充分平衡層析柱。
3.?增加結合時(shí)間
降低上樣流速讓蛋白和介質(zhì)有充分的接觸時(shí)間。
4.?更換更優(yōu)層析介質(zhì)
親和介質(zhì)分類(lèi)，一類(lèi)是特異性結合一種蛋白，另一類(lèi)是特異性結合一類(lèi)蛋白。（如蛋白a介質(zhì)結合一種蛋白，而肝素個(gè)質(zhì)結合一類(lèi)蛋白。所以選擇的時(shí)候我們一定要了解其原理。）
?
蛋白結合在柱子未洗脫出
1.?蛋白和介質(zhì)結合力過(guò)強
增加洗脫強度（his蛋白和鎳柱結合，可以增加取代基咪唑的濃度）。
2.?蛋白聚集在層析柱上
通過(guò)調整層析過(guò)程的緩沖液增加蛋白的穩定性，改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。
聚集在層析柱上時(shí)就要對層析柱進(jìn)行CIP清洗。
?
低分辨率（洗脫后純度低）
1.層析過(guò)程流速的影響
調整層析過(guò)程的流速，流速影響蛋白質(zhì)和介質(zhì)的親和力，層析時(shí)要選擇合適的流速。
2.柱床未充分淋洗
上樣后，要對柱床進(jìn)行充分的淋洗，將未和介質(zhì)結合的留在介質(zhì)顆粒間隙，孔內的蛋白洗出來(lái)，再洗脫。
3.蛋白之間的非特性結合
優(yōu)化體系緩沖液（比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結合）。
4.介質(zhì)的非特異性結合
優(yōu)化緩沖液，減少層析過(guò)程的非特異性結合（如His蛋白用金屬鰲合填料純化時(shí)，可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉，減少蛋白和介質(zhì)的非特異性結合）。
5.洗脫過(guò)程的影響
如肝素柱子洗脫過(guò)程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性，His標簽蛋白和金屬鰲合介質(zhì)結合后，洗脫時(shí)拉咪唑梯度可以提高純度。
?
蛋白質(zhì)純化過(guò)程中失活
1.蛋白去折疊或聚集
優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質(zhì)保持穩定。蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。
2.純化過(guò)程中保持蛋白的活性的輔助因子被法除
如一些酶類(lèi)的活性需要金屬離子輔助其活性，在純化過(guò)程中就要添加蛋白的活性輔助因子。
