Contichrom? CUBE層析系統可采用批處理和連續周期逆流（PCC）進(jìn)行目標蛋白親和層析純化。PCC可使捕獲環(huán)節層析填料的利用率顯著(zhù)提高，其與傳統批處理相比，可普遍提高40% - 60%。此外，還可使產(chǎn)量提高2倍。該系統具有更快的處理速度，可縮短目標蛋白在上樣過(guò)程中與蛋白酶和糖苷酶的接觸時(shí)間，從而保護蛋白完整性。簡(jiǎn)化的雙柱位配置，最大限度地降低了硬件故障風(fēng)險。2C-PCC (CaptureSMB?)是最簡(jiǎn)化和最有效的PCC設計。
本應用手冊介紹了Contichrom? CUBE FPLC系統CaptureSMB?動(dòng)態(tài)過(guò)程控制——AutomAb?如何在層析填料結合載量發(fā)生變化的情況下進(jìn)行調整。層析填料結合載量的變化，是由于填料在使用過(guò)程中的損耗或上樣蛋白濃度不同、成分改變等造成的。該動(dòng)態(tài)控制是與FDA所提倡的通過(guò)過(guò)程分析技術(shù)（PAT）提高產(chǎn)品質(zhì)量相一致的。
產(chǎn)品介紹
連續流層析可獲得更高的產(chǎn)量，且成本更低，這是通過(guò)降低Protein A 填料用量和緩沖液消耗量實(shí)現的。由于操作穩定，其可更好地保證產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。為保證連續工藝處于最佳設定點(diǎn)，需要進(jìn)行動(dòng)態(tài)過(guò)程控制。PCC工藝的高產(chǎn)量可使投入降低，設備占地面積更小，卻可提供與更大規格的普通設備相同的產(chǎn)出。
2C-PCC (CaptureSMB?)基礎理論
2C-PCC 僅用2根層析柱即可實(shí)現循環(huán)化捕獲純化過(guò)程（圖1），這是最簡(jiǎn)化和最穩定的多柱捕獲過(guò)程，并已被科學(xué)證實(shí)，這比其它多柱配置更為有效。* 2C-PCC采用優(yōu)化的子過(guò)程進(jìn)行上樣、淋洗、在位清洗和再生，2根層析柱恰當連接或獨立運行。親和填料價(jià)格昂貴，通過(guò)優(yōu)化上樣工藝，可使親和填料達到完全滿(mǎn)載，利用率達到最高。
圖1. ?2C-PCC (CaptureSMBa)原理
步驟?1：在連續上樣階段，柱1和柱2保持串聯(lián)。柱1滿(mǎn)載樣品（紅色），其流穿被柱2捕獲。
步驟?2：柱1進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時(shí)柱2進(jìn)行連續上樣。
步驟?3： 柱1再生完畢后，將層析柱進(jìn)行串聯(lián)，柱2滿(mǎn)載后，其流穿被柱1捕獲。
步驟?4：柱2進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時(shí)柱1進(jìn)行連續上樣。該連續處理方法循環(huán)進(jìn)行。
圖2.普通層析和PCC載量利用率對比圖。圖A為批處理上樣。在批處理的捕獲過(guò)程中，當樣品出現流穿時(shí)，上樣必須結束，從而避免樣品損失。圖B：在2C-PCC連續上樣階段，第1根層析柱進(jìn)行上樣，直至出現流穿（例如70%流穿），流穿樣品被第2根層析柱捕獲。因此，第1根層析柱的載量利用率得到顯著(zhù)提高。
Contichrom? CUBE系統進(jìn)行2C-PCC
Contichrom? CUBE系統可進(jìn)行目標分子的連續純化。其建立雙柱位Contichrom?平臺旨在簡(jiǎn)化系統配置和操作處理。其捕獲過(guò)程動(dòng)態(tài)控制功能AutomAb?是Contichrom? CUBE的關(guān)鍵功能。雙柱位設計不僅更可靠，而且比普通批處理和其它多柱位設計效率更高（圖3）。
圖3.載量利用率> 90%的多柱位系統產(chǎn)量對比圖。其顯示了典型上樣濃度2.5 g/L和5 g/L的影響結果。2C-PCC比普通批處理和更復雜的3柱位、4柱位設計更具優(yōu)勢。*
動(dòng)態(tài)過(guò)程控制原理
Contichrom? CUBE層析系統采用獨特的過(guò)程控制程序——AutomAb?自動(dòng)糾正過(guò)程中的偏差，從而使其保持在設定點(diǎn)。AutomAb?可以監測并控制層析柱的飽和水平，且可以自動(dòng)進(jìn)行調整。如果工藝參數發(fā)生變化，比如樣品成分的變化（包括目標蛋白質(zhì)量或濃度的變化）或層析填料載量的變化，上樣時(shí)間也會(huì )進(jìn)行相應調整。層析填料的載量會(huì )由于親和配基的脫落而發(fā)生變化，例如用于mAb純化的Protein A。
該系統也可運行固化的過(guò)程控制，即運行預先設定的固定層析過(guò)程控制。無(wú)論該過(guò)程引入任何變化，都會(huì )被排斥掉，這將導致獲得的目標產(chǎn)品的濃度和質(zhì)量發(fā)生改變。因此，當進(jìn)行連續工藝生產(chǎn)時(shí)，動(dòng)態(tài)過(guò)程控制必不可少。
*參考文獻: Baur D., Angarita M., Müller-Sp?th T., Steinebach F., Morbidelli M. 2016. Comparison of batch and continuous multi-column protein A capture processes by optimal design. Biotechnology Journal. 11: 1860-7314.
AutomAb? 控制的定義
AutomAb? 是一種保證捕獲過(guò)程處于最優(yōu)的控制工具，即使在過(guò)程參數發(fā)生變化時(shí)也不例外。當2根層析柱串聯(lián)后上樣，第2根層析柱可以接收第1根層析柱的流穿(預上樣) 。AutomAb? 可以通過(guò)控制相關(guān)聯(lián)的上樣時(shí)間來(lái)保證預上樣面積恒定，從而保證在連續上樣過(guò)程中，上樣至下一根層析柱的樣品量保持相同。預上樣面積可由使用者自行確定，也可由AutomAb?在第1次循環(huán)中計算得到。
其它的動(dòng)態(tài)過(guò)程控制系統是通過(guò)測定柱前、柱后的UV 信號相對值來(lái)進(jìn)行判斷的，這需要1套額外的檢測器。然而AutomAb?僅需要1套UV檢測器位于2根層析柱之間即可（圖4）。因此，AutomAb? 消除了由于UV檢測器校準偏差所造成的錯誤風(fēng)險。
圖4. 2C-PCC系統的每根層析柱都有其專(zhuān)屬的UV檢測器位于柱后。層析柱連接后，第1根層析柱的流出端UV信號，也同樣是第2根層析柱的流入端UV信號（見(jiàn)上圖UV1）。AutomAb? 監測第1根層析柱的流出端UV信號并保證mAb持續上至第2根層析柱。
AutomAb? 控制操作
2C-PCC進(jìn)行多次循環(huán)操作后，層析柱載量會(huì )同單柱位捕獲一樣降低，例如填料的protein A配基密度降低導致。該影響通?？稍谥貜颓逑?淋洗以及堿處理后觀(guān)察到。其結果是，導致預上樣面積值縮小。同樣，蛋白濃度會(huì )隨時(shí)間增長(cháng)或降低（例如灌流細胞培養），從而導致預上樣到達時(shí)間提前或延遲。無(wú)論預上樣與之前的循環(huán)相比提前還是延遲，AutomAb?可以通過(guò)自動(dòng)調整上樣時(shí)間來(lái)保證預上樣面積恒定。因此，填料利用率和抗體回收率仍然保持在最優(yōu)水平。該控制系統還可以消除柱效差異所導致的不同流穿曲線(xiàn)形狀影響（圖5）。
圖5. AutomAb?控制的2C-PCC 圖譜。柱效差異所導致的流穿曲線(xiàn)形狀（紅線(xiàn)：柱1；藍線(xiàn)：柱2）并不影響預上樣。
增加控制的靈活性
與其它多柱位PCC相比，其連續上樣與回收、再生的執行是完全獨立的，這避免了限速步驟（如長(cháng)時(shí)間CIP）與連續上樣并行進(jìn)行。因此，AutomAb?可徹底控制連續上樣時(shí)間。這保證連續上樣步驟在不同上樣濃度和載量降低的情況下，仍可在最大流速下進(jìn)行。
2C-PCC設計與 AutomAb?
使用CaptureSMB? 向導，可以通過(guò)單次流穿曲線(xiàn)數據得到2C-PCC 運行方法（見(jiàn)圖6）。該方法可顯示最優(yōu)的2C-PCC操作要點(diǎn)，該向導可顯示預期的運行狀態(tài)，例如產(chǎn)量、載量利用率、緩沖液和樣品消耗量、產(chǎn)品濃度以及運行時(shí)間?？稍谙驅е羞x擇AutomAb?控制，當運行啟動(dòng)時(shí)該選擇即被激發(fā)，此后，AutomAb?即可保持最優(yōu)控制點(diǎn)。
圖6. CaptureSMB 向導生成方法流程圖。AutomAb?控制為可選項。
結 論
毫無(wú)疑問(wèn)，連續流層析可顯著(zhù)提高下游純化的產(chǎn)量。然而。若沒(méi)有動(dòng)態(tài)過(guò)程控制，則需要設定額外的安全范圍來(lái)避免洗脫產(chǎn)物發(fā)生變化，這將導致工藝缺乏可靠性或造成產(chǎn)品損失。
AutomAb?動(dòng)態(tài)控制功能可保證2C-PCC實(shí)現最優(yōu)操作。在各種情況下，例如樣品濃度或層析填料載量的變化，都是可以得到補償的。AutomAb? 確保連續流層析可用于處理存在上樣成分變化的 灌流細胞培養。
