? ? ?有人問(wèn)到：“我的工藝是流穿模式，是否需要評價(jià)柱效？”還有人問(wèn)到：“我的工藝是親和層析，單梯度洗脫，不用擔心拖尾，是否需要評價(jià)柱效？”今天，小編為大家進(jìn)行統一解答。
什么是柱效？
? ? ?柱效（column efficiency），是指層析柱保留某一物質(zhì)而不使其擴散的能力。柱效越高，則分離度越高。
塔板理論及柱效評價(jià)標準
? ? ? 馬?。∕artin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將層析柱比作蒸餾塔，把一根層析柱設想成由許多小段組成。在每一小段內，一部分空間為固定相占據，另一部分空間充滿(mǎn)流動(dòng)相。組分隨流動(dòng)相進(jìn)入層析柱后，就在兩相間進(jìn)行分配。并假定在每一小段內組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個(gè)小段稱(chēng)作一個(gè)理論塔板（theoretical plate）。經(jīng)過(guò)多次分配平衡，分配系數小的組分先離開(kāi)蒸餾塔，分配系數大的組分后離開(kāi)蒸餾塔。
理論塔板數（N）計算公式：
? ? ? 該公式中的Ve，必須從進(jìn)樣時(shí)起算。
? ? ??每米理論塔板數（N/m）=理論塔板數（N） ÷ 柱床高度。
? ? ? HETP（height equivalent of theoretical plate），理論塔板等量高度，即每一層理論塔板的高度。
? ? ? 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，每米理論塔板數，是指每米有多少層；HETP，是指每一層有多高?？梢哉f(shuō)兩者是互為倒數的關(guān)系。
? ? ?評價(jià)標準：一般情況下，認為HETP ＜4倍粒徑大小即為比較理想的柱效。比如裝填平均粒徑90 μm的Sepharose填料，則要求HETP ＜360 μm，通過(guò)計算，要求每米理論塔板數 ＞2778?；蚩筛鶕?shí)際情況，將柱效標準定為每米理論塔板數 ≥3000。
對稱(chēng)性，也稱(chēng)峰不對稱(chēng)因子（Asymmetry, As），用來(lái)評價(jià)層析柱裝填的均勻程度。
? ? ??As?=b/a。As ＞1，說(shuō)明裝填偏松，表現為峰拖尾；As ＜1，說(shuō)明裝填偏緊，表現為峰前沿。若對分離度有較高要求，可把標準定為0.8 ＜As ＜1.2；若對分離度要求并不高，可把標準定為0.8 ＜As ＜1.5，甚至更寬的范圍。
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是否一定要評價(jià)柱效？
? ? ? 總體來(lái)說(shuō)，還是建議進(jìn)行柱效評價(jià)的，但柱效評價(jià)標準不能一概而論。
? ? ??高標準：1）分子篩層析；2）反相層析；3）疏水層析；4）采用階性梯度或線(xiàn)性梯度洗脫的離子交換層析。此類(lèi)層析對分離度有較高要求，有些需要采用多梯度洗脫或線(xiàn)性洗脫，如果柱效不佳，往往會(huì )造成峰擴散或拖尾，會(huì )對純化效果產(chǎn)生很大影響。建議標準：HETP ＜4倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.2。
? ? ? 低標準：1）親和層析；2）采用單梯度洗脫的離子交換層析。此類(lèi)層析僅需采用單梯度洗脫，有時(shí)在產(chǎn)物洗脫下來(lái)后，還要立即進(jìn)行稀釋?zhuān)苑喇a(chǎn)物聚集，因此對分離度要求較低。然而，過(guò)于嚴重的峰擴散和拖尾，也是會(huì )影響純化效率的，因此柱效測定也必不可少。建議標準：HETP ＜5倍粒徑，0.8 ＜As ＜1.5。
? ? ? 僅要求峰型及對稱(chēng)性：流穿模式。此類(lèi)模式為目標產(chǎn)物流穿，雜質(zhì)被吸附，如果填料裝填不均勻，或者過(guò)于松散，仍會(huì )導致吸附不勻而影響載量和處理量。因此，評估柱效時(shí)建議觀(guān)察一下峰型及對稱(chēng)性，如果峰型平滑，且對稱(chēng)性良好，即可接受。建議標準：0.8 ＜As ＜1.5。當然，如果裝填工藝穩定，甚至進(jìn)行了工藝驗證，該模式也可以不進(jìn)行柱效評價(jià)。
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柱效評價(jià)的常見(jiàn)問(wèn)題及處理
前沿峰
可能原因：壓縮過(guò)緊。
解決辦法：重新裝填。
拖尾峰
可能原因：1）壓縮過(guò)松；2）管路過(guò)粗，或檢測器流通池體積過(guò)大，造成稀釋效應。
解決辦法：1）重新裝填；2）檢查管路及檢測器流通池規格是否匹配。
低柱效
? ? ? 可能原因：1）沉降不均勻；2）碎填料過(guò)多；3）檢測器或泵故障。
? ? ??解決辦法：1）降低勻漿濃度，確保攪拌均勻后一次性緩慢倒入層析柱；2）去除碎填料；3）檢查檢測器及泵是否正常；4）考慮更換為粒徑更細的填料以提高柱效，如TOSOH聚合物基材填料（http://www.accessingnature.com/brand/view/1.html）。
峰型不佳
? ? ? 可能原因：1）柱床中心凹陷，或柱床與篩網(wǎng)之間存有氣泡，導致樣品流動(dòng)不均勻（樣品需要繞過(guò)凹陷區或氣泡）；2）裝填不均勻，甚至內部有裂縫；3）篩網(wǎng)堵塞，導致樣品流動(dòng)不均勻；4）層析柱無(wú)分配器，或分配器設計不佳，導致偏流。
? ? ??解決辦法：1）重新裝柱，優(yōu)化裝柱策略；2）拆卸、清洗篩網(wǎng)，并確認篩網(wǎng)孔徑是否合適；3）采用具有合理分配器設計的層析柱。
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